DTT和TCEP作为蛋白质还原二硫键，使用上有什么不同

雨后彩虹

  DTT和TCEP作为蛋白质还原二硫键，使用上有什么不同

         二硫键，又称S−S键，是2个巯基被氧化而形成的−S−S−形式的硫原子间的共价键，在蛋白质分子的立体结构形成上起着一定的重要作用。为了确定蛋白质的一级结构，首先必须将二硫键打开，使之成为线状多肽链。DTT和TCEP是常用的还原二硫键的试剂，tcep还原二硫键机理[那二者在使用中有什么不同呢？

        DTT中文名称为二硫代苏糖醇，是苏糖醇的C-1及C-4位羟基置换成巯基的化合物，常常被用于蛋白质中二硫键的还原，可阻止蛋白质中的半胱氨酸之间所形成的蛋白质分子内或分子间二硫键。

        DTT有两个巯基基团，其作用能维持3~7天，挥发性不强，使用时可以直接加入到悬滴中去，或通过微透析的方法加入。但DTT往往无法还原包埋于蛋白质结构内部（溶剂不可及）的二硫键，这类二硫键的还原常常需要先将蛋白质变性（高温加热或加入变性剂，如盐酸胍、尿素或SDS）。反之，根据DTT存在情况下，二硫键还原速度的不同，可以判断其包埋程度的深浅。另外，DTT可以使Ni被还原，因此在用Ni柱纯化带有His标签的蛋白时要避免使用DTT，而应该考虑TECP。

         二硫键的断裂通常需要有大量的自由巯基和二硫键交换，三价膦系衍生物由于其较强的还原能力和对二硫键的选择还原性得到很多研究者的青睐。这类还原剂的还原是一个定量反应的过程，其原理是其中心原子“P”所带的孤电子对能与氧原子形成配位共价结合而具有还原性。如下式所示:

        TCEP，三(2-羰基乙基)磷盐酸盐，是三价磷系衍生物中作用最优的。它是一种无色、无味、易溶于水的弱还原性物质，在水中溶解度能达到310mg/mL。其在空气和水溶液中具有较高的稳定性，受温度和浓度的影响小。TCEP是一种极为合适的部分还原试剂，对还原二硫键选择性极强，除半胱氨酸外，几乎没有与其它氨基酸的副反应，并且能在更宽的pH值范围包括酸性条件(pH值3)下使用，从而有效减少酰胺键的水解。TCEP的反应活性温和、易溶、小，且更容易操作，在酸性、碱性溶液中的稳定性都很好。而且还原能力比DTT强，它的作用可以维持2~3周，是公认的DTT(二硫代苏糖醇)的一种良好替代物。

        DTT(二硫代苏糖醇)和TCEP（三(2-羰基乙基)磷盐酸盐）可以相互代替，只是效果不同而已。与DTT相比，TECP还原能力更强，更具有选择性；无论在酸性还是碱性条件下都更加稳定；本身不带有电荷，不影响后续的实验。TCEP不仅是一种高效的二硫键还原剂，而且在某些巯基的交联反应中不需要除掉，因而在蛋白质化学及蛋白质组学研究常常优先选择TCEP。

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